Traguardi raggiunti e promesse imminenti per l’editing genomico di nuova generazione

Una buona definizione di 'collage' è quella di un’opera realizzata mediante inserzione di pezzi, citazioni e contesti provenienti da varie altre opere, dello stesso autore o di altri autori. Con la terapia genica si può intervenire grossomodo alla stessa maniera, modificando le funzioni dei geni attraverso inserzioni e delezioni di frammenti di DNA. Naturalmente, per poter fare ciò è necessaria un’estrema conoscenza dei geni e delle loro funzioni.

Le tecniche di ricombinazione omologa hanno aperta la strada a questo genere di operazioni facilitando la creazione di modelli cellulari e animali (murini) da impiegare in protocolli di ricerca sempre più precisi ed accurati. Col tempo, le tecniche sono state affinate giungendo a metodiche di editing del genoma che impiegano nucleasi artificiali quali le zinc-finger nucleases (ZFN) e gli attivatori delle nucleasi dell’effettore della trascrizione (transcription activator-like effector nucleases, TALENs). Si tratta di un pannello di proteine che si legano a sequenze specifiche del DNA e ne modificano la sequenza, inducendone la correzione. Tuttavia, i costi associati a queste metodiche e, soprattutto, i rischi di inserzioni non controllate che siano causa di mutazioni hanno sempre rappresentato un ostacolo che, in tempi recenti, è stato parzialmente superato dalla tecnologia CRISPR-Cas9, una combinazione formata da enzimi che tagliano il filamento originale e da brevi sequenze di DNA in grado di legarsi alla sequenza di DNA colpita da mutazione, correggendo, di fatto, l’errore.

In questo senso la parola 'collage' ha un significato che rimanda all’operazione svolta. Le sequenze Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (in una sigla, CRISPR) sono state scoperte nei batteri all’interno dei quali svolgono una funzione protettiva nei confronti delle infezioni. Tuttavia, a fare la differenza per l’applicabilità del modello CRISPR-Cas9 sono le nucleasi Cas9 che, sfruttando un filamento guida di RNA (crRNA), tagliano il DNA in posizioni specifiche consentendo l’inserimento della sequenza là dove è necessaria. Questo modello ha consentito un incredibile balzo in avanti alla tecniche di ingegneria genetica e, oggi, le sue applicazioni in vitro e in vivo hanno prodotto risultati di enorme portata. Il sistema CRISPR-Cas9 può essere configurato come una piattaforma di analisi della perdita di funzione di determinati pacchetti di geni, oppure può dare risultati importanti nel blocco dei processi trascrizionali di proteine difettose limitando i cosiddetti effetti 'off-target'.

In una recente revisione apparsa sulla rivista British Journal of Hematology, due ricercatori del Brown Foundation Institute of Molecular Medicine for The Prevention of Human Diseases di Houston, hanno fatto il punto sui successi e i traguardi raggiunti attraverso l’uso del sistema CRISPR-Cas9 nel trattamento di patologie ematologiche come le anemie e i linfomi, mettendo in risalto le possibili frontiere di applicazione e i limiti della metodica.

Patologie ematologiche non oncologiche

La beta-talassemia, l’anemia falciforme, l’anemia di Fanconi e l’anemia di Diamond-Blackfan, insieme alla trombocitopenia e all’emofilia sono i maggiori campi di sfruttamento della tecnica CRISPR-Cas9 al di fuori del settore oncologico. Il minimo comune denominatore di ognuna è, ovviamente, l’origine genetica. Nel caso della beta-talassemia, l’editing genetico si è rivelato un’opzione terapeutica alternativa al trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche. Sfruttando le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), è possibile, grazie al sistema CRISPR-Cas9 un ripristino della produzione delle catene di beta globina (HBB), essenziali per la sintesi di emoglobina. Una volta reinfuse nel paziente, le iPSCs ingegnerizzate iniziano a produrre nuove cellule ematopoietiche sane. Addirittura, in uno studio di recente realizzazione, i fibroblasti sono stati riprogrammati per divenire iPSCs naive geneticamente manipolate e con una maggior efficacia d’azione e di differenziamento. Anche nel caso dell’anemia falciforme, la tecnica CRISPR-Cas9 ha prodotto interessanti risultati, prendendo a bersaglio il gene HBB, responsabile della malattia e dimostrando un’efficienza di gran lunga superiore a quella ottenuta con le tecniche di editing che sfruttino ZFN e TALENs. Nei pazienti con anemia di Fanconi sono state le cellule somatiche ad essere riprogrammate in iPSCs mentre per l’anemia di Diamond-Blackfan il risultato più promettente è legato all’inattivazione del gene tp53 negli eritrociti. Un po' più scarsi sulla trombocitopenia – i cui risultati preliminari confermano comunque la possibilità di aumentare la produzione di piastrine – promettono decisamente meglio gli studi nel campo dell’emofilia: qui la tecnica CRISPR-Cas9 è stata ampiamente sperimentata per indurre la produzione del fattore di coagulazione VIII (emofilia A) e IX (emofilia B) rispettivamente in iPSCs ottenute da pazienti con emofilia A e in modelli murini su cui è stato sviluppato un sistema di correzione di una nuova mutazione legata all’emofilia di tipo B.

Patologie ematologiche oncologiche

Il maggior problema riconducibile ai linfomi rimane il rischio di recidiva e refrattarietà al trattamento. Il ricorso al sistema CRISPR-Cas9 su questo tipo di tumore è volto sostanzialmente all’approfondimento dei meccanismi di resistenza alla terapia farmacologica e all’identificazione dei bersagli terapeutici ideali. Similmente, per quel che riguarda il mieloma, la metodica CRISPR-Cas9 è stata impiegata per silenziare MUC1-C al fine di bloccare la progressione tumorale. Le leucemie sono un terreno di prova unico per la CRSIPR-Cas9, sfruttata sia per l’editing genomico ex vivo, sia per veicolare versioni funzionali dei geni all'interno di linee cellulari in vitro, con un consistente aumento di pubblicazioni in materia, centrate non solo su protocolli di silenziamento genico ma anche di inserzione di sequenze genetiche a scopo terapeutico.

La tecnica CRSIPR-Cas9 sta offrendo spunti di ricerca anche nella lotta ad altre patologie ematologiche quali la malattia granulomatosa cronica, l’infezione da HIV o EBV o la malaria, confermando il suo alto grado di versatilità e l’estrema potenzialità d’azione in chiave terapeutica per patologie che fino a qualche anno fa non avevano cura. Tuttavia, si tratta di una metodica giovane, che deve essere approfondita e collaudata per superare quelli che ora appaiono ostacoli di non trascurabile entità, come la stabilità della risposta o gli effetti off-target, vale a dire i tagli eseguiti in siti errati che possono causare danni anche gravi, innescando addirittura processi oncologici. A questo proposito si sta predisponendo una batteria di strumenti bioinformatici in grado di predire i siti di taglio e innesto, ma la loro efficienza è tutt’ora in fase di studio. E, naturalmente, ci sono molti nodi da sciogliere sul piano etico in relazione alla manipolazione della linea germinale.

Per tracciare una correlazione con l’universo calcistico, le patologie ematologiche rappresentano il campo da gioco ideale di una partita nella quale la squadra di casa, potrà schierare un giovane ed entusiasmante attaccante che, dopo esser stato testato e formato dall’allenatore, sarà pronto a sfornare gol e portare a casa un risultato eccezionale.

Per maggiori informazioni visita la sezione di OMaR dedicata alla tecnica di editing genomico CRISPR-Cas9.