Ricerca scientifica

Prof. Vincenzo Nigro (Napoli): “NGS è l’acronimo di una tecnica di analisi. Deve essere un genetista medico clinico a suggerire quale test scegliere per la lettura del DNA”

Chi non conosce il significato di “test genetico” alzi la mano. Si tratta di un concetto che è entrato a far parte del linguaggio comune: un test di conferma diagnostica, oppure un esame per capire se si è “portatori” di qualcosa.  Ma, se si tratta di descrivere le differenze tra un test e l’altro o di interpretarne i risultati, chi ha davvero le idee chiare? Per molti la sigla NGS - Next Generation Sequencing - non ha alcun significato particolare, tuttavia capirne il significato è fondamentale per restare al passo con la pratica medica contemporanea.

Questo approfondimento, realizzato nell’ambito della partnership di Osservatorio Malattie Rare con SIGU, Società di Genetica Umana, vuole offrire una prospettiva chiara sulla tematica. Per farlo ci siamo rivolti al professor Vincenzo Nigro, ordinario di Genetica Medica all’Università della Campania ‘Luigi Vanvitelli’ di  Napoli e Ricercatore al Tigem di Pozzuoli.

COSA SIGNIFICA LEGGERE IL DNA?

Il sequenziamento del DNA è una procedura indispensabile per poter cercare una mutazione alla base di una malattia ereditaria, oltre a rappresentare il primo passo verso possibili pratiche di manipolazione ed eventuale correzione della suddetta mutazione. “Dobbiamo immaginare di ridurre la doppia elica di DNA in tanti piccoli frammenti – spiega Nigro - come se facessimo a pezzi un intero libro. Poi prendiamo i pezzi corrispondenti a un determinato capitolo e ne leggiamo il contenuto - poche parole e qualche frase. Infine, grazie a software informatici ad altissime prestazioni dobbiamo confrontare il contenuto dei frammenti con il manoscritto originale.”

Le prime tecniche di sequenziamento del DNA sono state introdotte alla fine degli anni Settanta del secolo scorso: fu Frederick Sanger a realizzare, nel 1977, un sistema manuale per la lettura del DNA che, nel giro di una settimana, permetteva ai ricercatori di leggere alcune centinaia di basi che compongono la sequenza. L’idea fu talmente geniale da fruttare a Sanger un Premio Nobel - il secondo della sua brillante carriera dopo quello per la scoperta della struttura dell’insulina - e spianare la strada ai sequenziatori automatici che, col crescere del livello tecnologico, sono giunti a leggere miliardi di basi di DNA in poche ore. 

I primi due decenni del XXI secolo sono stati dunque la cornice temporale dell’esplosione dei test genetici, ma il punto di partenza ideale rimane il sequenziamento di un intero Genoma Umano - un progetto della cui conclusione si sono da poco celebrati i vent’anni. “Pochi anni dopo quel momento storico fondamentale per la genetica, sono sorte le prime applicazioni dei test NGS da cui si è vista immediatamente la possibilità di leggere in parallelo le sequenze di DNA”, racconta il “Nel corso degli anni abbiamo assistito a una poderosa evoluzione nelle capacità di lettura, tanto che oggi esistono strumentazioni in grado di leggere fino a 10 mila miliardi di lettere del DNA per giorno

COSA SONO I TEST NGS? PANNELLI, ESOMA E GENOMA

“Si stima che circa l’85% del genoma possa essere letto con la tecnologia NGS -  precisa Nigro - Nell’ambito di questa grande frazione leggibile, l’80% delle cause di malattia risulta potenzialmente interpretabile, quando il gene è noto”.

“A seconda dell’ampiezza della porzione di genoma analizzata i test NGS hanno caratteristiche differenti - prosegue Nigro - Alcuni di essi sono composti da pannelli per il sequenziamento mirato di alcuni geni (essi identificano fino a 200 cambiamenti nel DNA). Poi ci sono i test per il sequenziamento dell’esoma clinico, o mendelioma, che identificano i geni connessi a malattie genetiche note.
Ancora più in alto in graduatoria, ci sono i test per il sequenziamento dell’intero esoma (Whole Exome Sequencing, WES), capaci di leggere fino a 50 milioni di basi del DNA, identificando fino a 60 mila cambiamenti. Infine, ci sono i test per il sequenziamento dell’intero genoma (Whole Genome Sequencing, WGS) che leggono fino a oltre 3 miliardi di paia di basi, identificando fino a 5 milioni di cambiamenti”. Questi ultimi sono in grado di cogliere praticamente tutte le differenze genetiche che esistono tra il genoma di un individuo e quello di riferimento.

A COSA SERVONO I TEST NGS?

Come si può intuire, la dicitura NGS è piuttosto vaga: è equivalente a sedersi al tavolo di un ristorante e richiedere del vino, ma esistono più varietà, differenti per intensità e aroma, che possono o meno abbinarsi con i piatti ordinati. Bisogna saper fare la scelta corretta. Nel caso dei test NGS, oltre al potere di risoluzione occorre poter fare una distinzione anche sulla base della funzione. Alcuni, infatti, sono test diagnostici perché permettono di confermare una diagnosi e inquadrare una data malattia; poi ci sono i test per individuare la presenza di mutazioni comuni all’interno di una popolazione di individui a rischio (ad esempio i familiari di una persona che abbia ricevuto la diagnosi di malattia ereditaria); ci sono test presintomatici, per identificare mutazioni che anticipino la presenza di una malattia e altri ancora per confrontare regioni diverse del DNA e capire se una traccia biologica corrisponde a una data persona (vengono utilizzati prevalentemente nella genetica forense).

“I test genetici trovano impiego anche in epoca prenatale, per capire se il feto sia affetto da anomalie cromosomiche”, precisa Nigro. “È il caso del NIPT, o test del DNA fetale, che permette di eseguire l’analisi a partire dal sangue materno su cui si va a ricercare la presenza di DNA fetale circolante. Il NIPT è un test fondamentale nel caso in cui la donna in gravidanza abbia già una certa età, poichè è risaputo che, con l’avanzare dell’età, aumenta la possibilità di sviluppare anomalie cromosomiche tali da implicare nel nascituro le sindromi di Down o di Edwards”.

A QUALE TEST NGS SOTTOPORSI?

La risoluzione dei vari test NGS consente di leggere più o meno a fondo il DNA: i pannelli effettuano un maggior numero di letture dei singoli tratti di DNA perciò sono più sensibili del WGS che, dovendo leggere tutto il genoma, effettua un minor numero di passaggi ma copre un territorio più ampio, andando alla ricerca di mutazioni su tutto il DNA. “Sulla base delle differenze tecniche e degli obiettivi d’indagine, il genetista medico clinico che ha in capo la valutazione del caso deve saper suggerire al paziente quale test eseguire”, afferma Nigro. “Ad esempio, sono note quasi un centinaio di forme di paraplegia spastica ereditaria e molti casi sono ancora senza diagnosi pertanto sarebbe riduttivo procedere con il sequenziamento mirato dei singoli geni tramite i pannelli ed è, invece, ragionevole scegliere il sequenziamento dell’esoma per avere traccia anche di varianti in geni nuovi. Al contrario, laddove la causa genetica sia nota, si procede con i pannelli disegnati ad hoc, che effettuano un’indagine mirata, riducendo anche i costi dell’analisi”. WES o WGS, trovano maggior utilità per individuare le mutazioni responsabili di una malattia di cui, però, non si conosce il gene responsabile: è il caso di molte persone affette da patologie che non hanno ancora una diagnosi certa. “Come è intuibile alcuni test hanno un rumore di fondo di poche centinaia di basi e altri, invece, di diverse migliaia – spiega ancora l’esperto - C’è il rischio che si perdano informazioni perciò l’esperienza dei tecnici e dei biologi deve essere solida. O si rischia di dire al paziente che non ha una certa mutazione solo perché non si è stati in grado di rilevarla con il test usato”.

DI QUALI REQUISITI DEVE ESSERE IN POSSESSO UN LABORATORIO PER FARE NGS?

Innanzitutto, i laboratori devono conoscere a menadito tutte le tecniche disponibili. Servono esperti bioinformatici che sappiano eseguire le analisi e tecnici per utilizzare i software e la strumentazione ad elevata sofisticazione, ma soprattutto esperti genetisti che conoscano la malattia in tutte le sue manifestazioni e caratteristiche: la potenza interpretativa di un test NGS ha un ruolo predominante perciò chi esegue test NGS su pazienti con malattie senza diagnosi deve affrontare un estremo livello di complessità e confrontarsi con un impressionane volume di informazioni.

“Ogni anno, inoltre, si identificano circa 200 nuovi geni correlati a possibili malattie”, continua Nigro. “Ciò significa che i dati informatici dei pazienti devono essere periodicamente sottoposti a ri-esame e nuove analisi dal momento che, con gli attuali ritmi di aggiornamento, un test negativo, eseguito nel 2018, potrebbe risultare oggi positivo vista l’aggiunta di circa 1200 geni da indagare”. Tale indicazione è contenuta nelle raccomandazioni della SIGU (Società Italiana di Genetica Umana) per l’impiego clinico dei test di sequenziamento di ultima generazione che lo stesso professor Nigro ha contribuito a redigere.

Diventa evidente come il costo delle analisi - incluse le seconde analisi - si faccia pesante e come pure i tempi necessari per avere un risultato spesso si dilatino notevolmente. “Quando siamo in presenza di una malattia frequente si procede con i pannelli che esaminano il materiale in maniera puntiforme e danno una risposta in tempi rapidi”, aggiunge Nigro. “Questo permette di dare una risposta a molti casi immediatamente risolvibili. Gli altri devono essere indirizzati verso i centri specializzati seguendo un percorso ben definito”.

COME DEVE ESSER EROGATO IL RISULTATO DI UN TEST NGS?

Mettersi in rapporto con la complessità dei test NGS significa adottare una metodologia che preveda, alla fine dell’analisi, una risposta chiara ed univoca. “Non basta fornire al paziente un lungo elenco di varianti geniche senza un adeguato supporto di consulenza mediante cui filtrare quelle importanti e distinguerle dalle altre”, dichiara Nigro. “L’informazione scientifica deve essere tecnicamente aggiornata e, allo stesso tempo, fruibile per il destinatario ultimo, cioè il paziente. Quest’ultimo passaggio vien espletato dal genetista medico nell’ambito della consulenza genetica. È la competenza più preziosa e costosa perché incarna l’autentico concetto di presa in carico della persona”. La consulenza genetica è un momento complesso che si espande su vari livelli: da quello che prevede il confronto sui temi della diagnosi per capire quali test usare, a quello sulla prognosi e trattamento della patologia. “L’interpretazione del risultati del test per sapere se la malattia sia o meno presente è la parte più complessa e richiede tempo e competenza”, afferma Nigro. “Poi però bisogna saper comunicare alla persona interessata le dinamiche ereditarie della malattia e affrontare le possibilità di intervento”. È un momento multidisciplinare in cui tutti, dallo specialista della malattia, al genetista medico, fino allo psicologo devono assumersi le proprie responsabilità.

NGS: UN SERVIZIO NON ACCESSIBILE A TUTTI

Sebbene negli ultimi anni i costi di un test WES o di un WGS siano scesi significativamente - i singoli pannelli sono già sufficientemente economici da essere erogati da molti laboratori privati - le cifre medie per l’esecuzione di questi test si aggirano ancora intorno ai 2 mila euro, una soglia non facilmente accessibile a tutte le famiglie. Inoltre, l’esclusione dei test per il sequenziamento dell’esoma dall’ultimo aggiornamento dei LEA (Livelli Essenziali di Assistenza) non facilita le molte persone malate che stanno ancora cercando un nome per la loro condizione. Serve lo stanziamento di nuovi fondi per aprire l’accesso ai test a coloro che ne hanno bisogno e rendere questa tecnologia ancora più popolare.

Inoltre, una buona parte dei fondi va destinata ai centri specializzati che dovrebbero poter agire in maniera sinergica e coordinata. “Un esempio è dato dalla Rete IDEA (Associazione Rete Italiana salute dell’Età Evolutiva) che coinvolge varie strutture sul territorio italiano”, conclude Nigro. “Alcune di esse fanno parte di altre reti dedicate alle malattie rare e genetiche. Il vantaggio di tale situazione è che gli stessi attori prendano parte a più tavoli accomunati da un intento unico: generare connessioni tra i centri non solo in Italia, ma in tutta Europa, con percorsi chiari e ben stabiliti che portino tempestivamente i pazienti agli esperti. E con una notevole riduzione dei tempi di diagnosi”.

È un’operazione lungimirante che presuppone consistenti spese di gestione ma senza un cospicuo investimento oggi nella ricerca e nel progresso scientifico le possibilità future di arrivare a formulare rapidamente diagnosi complesse e migliorare ancora la qualità di vita di milioni di persone corrono il rischio di ridursi drammaticamente.